如何打開顯微共聚焦圖片

1. 共聚焦顯微技術的簡介

共聚焦顯微技術 是在熒光顯微分析技術的基礎上發展起來的，利用熒光顯微鏡可以對生物樣品發出的熒光進行觀察和分析，但是熒光顯微鏡收集到的是樣品的整體熒光，來自樣品內不同部位的熒光信號相互干擾。難以區分，無法獲得准確的定位和定量信息。 共聚焦顯微技術的出現很好地解決了這一問題，這一技術可以獲取細胞內某個薄層面上的熒光信息，而該層以外的信號被消除掉，成像清晰程度大大提高；結合計算機自動控制，可以對熒光信號的分布、強度和動態變化進行全方位的分析，得到豐富的信息。
與傳統顯微鏡相比共聚焦顯微鏡可抑制圖像的模糊，獲得清晰的圖像；具有更高的軸向解析度，並可獲取連續光學切片；增加側向解析度；由於點對點掃描去除了雜散光的影響。

2. 如何從共聚焦顯微鏡三維層掃圖獲得3d圖像

共焦顯微鏡[Confocal Laser Scanning Microscope(CLSM或LSCM)]在反射光的光路上加上了一塊半反半透鏡(Beam Splitter)，將已經通過透鏡的反射光折向其它方向，在其焦點上有一個帶有針孔（Pinhole）的擋板，小孔就位於焦點處，擋板後面是一個 光電倍增管（photomultiplier tube，PMT）。
可以想像，探測光焦點前後的反射光通過這一套共焦系統，必不能聚焦到小孔上，會被擋板擋住。
於是光度計測量的就是焦點處的反射光強度。

3. 共聚焦顯微技術的共聚焦顯微鏡實現方式

目前共聚焦的實現有兩種方式：激光共聚焦和數字共聚焦。 這種共聚焦技術利用激光 作為激發光源，將激光聚焦於樣品中的某一點，這樣只有該點附近的區域有熒光，其他沒有被激發的部位沒有熒光，這一區域發出的熒光反射到光電倍增管，在光電倍增管前設有1 個計算機控制的可調節針孔， 保證只有被激發點發出的熒光才能到達光電管，而附近其他點所發出的熒光被擋在視野之外。採用計算機控制激光和針孔， 對細胞內的某一層面進行掃描，可以獲得清晰的二維圖像。
這一技術成像速度快、自動化程度高。但激光具有單色性，一種激光器只能發出某幾個特定波長的激光，而熒光染料的種類很多，其激發光波長各不相同，這樣在使用某種型號的激光器時，只有少數幾種熒光染料可以使用， 而其他大多數的染料不能使用；目前同時配備數個不同激光器或多光子脈沖激光器的激光共聚焦系統的出現，雖然可以解決這一難題，但是設備結構復雜、價格昂貴，維護保養要求較高。 這一技術是隨著計算機軟體技術的發展出現的，與激光共聚焦的原理有極大的區別， 它在普通的熒光顯微鏡上加上1 個計算機控制的高解析度、帶有製冷裝置(以提高信噪比) 的CCD 攝像機， 攝像機獲取的圖像由計算機進行解卷積(deconvolution) 計算， 這種數字式圖像處理可以將聚焦平面以外的圖形信號刪除， 保留高清晰度的焦平面信息。
這一系統硬體配備比較簡單，價格遠遠低於激光共聚焦系統；由於使用可以發出連續光譜的高壓汞燈或氙燈作為光源，使這一技術幾乎可以用於所有的熒光染料，應用范圍廣泛， 其機械部分組成簡單，靈活性高。這一技術的不足在於其圖像獲取、計算對計算機的依賴性高，圖象獲取時間相對較長，實驗時除要分析的層面被激發外，細胞內其他部位也被激發， 增加了熒光染料的光淬滅，對某些容易被光淬滅的染料會造成明顯的影響；隨著計算機和攝像技術的發展，這些問題也在逐步解決。

4. 激光共聚焦顯微鏡得到的光學切片如何還原成三維模型

ImageJ保存三維圖片

1、ImageJ 1.50b File -> Open打開Stack圖片，Stack圖片具備有三個空間維度：X，Y和Z。

5. 激光掃描共聚焦顯微鏡的激光共聚焦顯微鏡結構

激光共聚焦掃描顯微鏡（Confocal laser scanning microscope，CLSM）用激光作掃描光源，逐點、逐行、逐面快速掃描成像，掃描的激光與熒光收集共用一個物鏡，物鏡的焦點即掃描激光的聚焦點，也是瞬時成像的物點。系統經一次調焦，掃描限制在樣品的一個平面內。調焦深度不一樣時，就可以獲得樣品不同深度層次的圖像，這些圖像信息都儲於計算機內，通過計算機分析和模擬，就能顯示細胞樣品的立體結構。
在結構 配置上，激光掃描共聚焦顯微鏡除了包括普通光學顯微鏡的基本構造外，還包括激光光源、掃描裝置、檢測器、計算機系統 (包括數據採集、處理、轉換、應用軟體)、圖像輸出設備、光學裝置和共聚焦系統等部分 [2]。由於該儀器具有高解析度、高靈敏度、「光學切片」（Optical sectioning）、三維重建、動態分析等優點，因而為基礎醫學與臨床醫學的研究提供了有效手段。此外，CLSM 對熒光樣品的觀察具有明顯的優勢，只要能用熒光探針進行標記的樣品就可用其觀察。
激光共聚焦掃描顯微鏡既可以用於觀察細胞形態，也可以用於細胞內生化成分的定量分析、光密度統計以及細胞形態的測量, 配合焦點穩定系統可以實現長時間活細胞動態觀察。

6. 熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡的區別

一、原理不同

1、熒光顯微鏡：是以紫外線為光源， 用以照射被檢物體， 使之發出熒光， 然後在顯微鏡下觀察物體的形狀及其所在位置。

2、激光共聚焦顯微鏡：在熒光顯微鏡成象的基礎上加裝激光掃描裝置，使用紫外光或可見光激發熒光探針。

二、特點不同

1、熒光顯微鏡：用於研究細胞內物質的吸收、運輸、化學物質的分布及定位等。 細胞中有些物質，如葉綠素等，受紫外線照射後可發熒光；另有一些物質本身雖不能發熒光，但如果用熒光染料或熒光抗體染色後，經紫外線照射亦可發熒光。

2、激光共聚焦顯微鏡：利用計算機進行圖象處理，從而得到細胞或組織內部微細結構的熒光圖象，以及在亞細胞水平上觀察諸如Ca2+、pH值、膜電位等生理信號及細胞形態的變化。

三、用處不同

1、熒光顯微鏡：熒光顯微鏡是免疫熒光細胞化學的基本工具。它是由光源、濾板系統和光學系統等主要部件組成。是利用一定波長的光激發標本發射熒光，通過物鏡和目鏡系統放大以觀察標本的熒光圖像。

2、激光共聚焦顯微鏡：激光掃描共聚焦顯微技術已用於細胞形態定位、立體結構重組、動態變化過程等研究，並提供定量熒光測定、定量圖像分析等實用研究手段，結合其他相關生物技術，在形態學、生理學、免疫學、遺傳學等分子細胞生物學領域 得到廣泛應用。

7. 怎樣在word里插入共聚焦圖片

插入-圖片-來自文件
找到文件，插入就行了
工具-選項-視圖
把圖片框的對勾去掉

8. 激光掃描共聚焦熒光顯微鏡的共聚焦掃描顯微鏡的成像原理

採用點光源照射標本，在焦平面上形成一個輪廓分明的小的光點，該點被照射後發出的熒光被物鏡收集，並沿原照射光路回送到由雙向色鏡構成的分光器。分光器將熒光直接送到探測器。光源和探測器前方都各有一個針孔，分別稱為照明針孔和探測針孔。兩者的幾何尺寸一致，約100-200nm；相對於焦平面上的光點，兩者是共軛的，即光點通過一系列的透鏡，最終可同時聚焦於照明針孔和探測針孔。這樣，來自焦平面的光，可以會聚在探測孔范圍之內，而來自焦平面上方或下方的散射光都被擋在探測孔之外而不能成像。以激光逐點掃描樣品，探測針孔後的光電倍增管也逐點獲得對應光點的共聚焦圖像，轉為數字信號傳輸至計算機，最終在屏幕上聚合成清晰的整個焦平面的共聚焦圖像。
每一幅焦平面圖像實際上是標本的光學橫切面，這個光學橫切面總是有一定厚度的，又稱為光學薄片。由於焦點處的光強遠大於非焦點處的光強，而且非焦平面光被針孔濾去，因此共聚焦系統的景深近似為零，沿Z軸方向的掃描可以實現光學斷層掃描，形成待觀察樣品聚焦光斑處二維的光學切片。把X-Y平面（焦平面）掃描與Z軸（光軸）掃描相結合，通過累加連續層次的二維圖像，經過專門的計算機軟體處理，可以獲得樣品的三維圖像。
即檢測針孔和光源針孔始終聚焦於同一點，使聚焦平面以外被激發的熒光不能進入檢測針孔。
激光共聚焦的工作原理簡單表達就是它採用激光為光源，在傳統熒光顯微鏡成像的基礎上，附加了激光掃描裝置和共軛聚焦裝置，通過計算機控制來進行數字化圖像採集和處理的系統。

9. 共聚焦顯微技術的共聚焦顯微技術的優點

成像清晰
由於利用光學或數字技術消除了聚焦平面以外的熒光信號的干擾, 使我們要分析的區域內的圖像清晰度提高, 得到更為准確的定位和定量信息。
連續片層掃描及圖像重組
共聚焦顯微鏡在計算機的控制下可以對樣品中的不同層面進行連續逐層掃描, 以獲得各個層面的圖像, 層面之間的間距可以達到0. 1微米甚至更小, 在圖像獲得後由計算機自動將這些圖形重組為三維圖像。與普通光學照相機獲得的圖像比較,共聚焦所得到的重組三維立體圖形清晰度高、層次分明、立體感更強, 通過計算機軟體處理, 可以對三維圖形進行任何形式的旋轉, 可以從任何角度進行觀察, 還可以對細胞內的某個選定結構進行長度、體積的測量和計算, 在分析細胞內的空間結構和某些物質在細胞內的精確定位方面具有明顯的優勢, 這也是共聚焦顯微技術諸多功能中應用最廣泛的一種。
多標記技術
利用共聚焦系統可以同時對利用兩種或三種不同的熒光染料分別標記了細胞的不同結構(如分別標記染色體和細胞骨架系統) 的樣品進行觀察, 這樣一次實驗觀察就可以獲得細胞內不同結構的信息, 對不同結構組分的定位、相互聯系方式進行研究。在最終獲得的圖像可以分開表示單個結構; 也可以將圖片迭加在一起, 用不同顏色表示不同的結構, 更加直觀, 這是普通熒光顯微鏡無法做到的。
活體觀察
除了可以對固定標本的細胞進行觀察外, 共聚焦顯微技術還可以在不對細胞進行固定或其他損傷性處理的情況下進行觀察, 獲得活細胞內 的信息, 顯示在活體情況下細胞內的真實結構和生理學特徵。更為重要的是利用共聚焦顯微鏡可以跟蹤自然狀態下或受某種因素刺激後活細胞內的結構和生理過程隨時間變化的情況, 得到准確而直觀的動態變化資料, 為分析細胞內的生理生化反應提供直接的實驗數據。
獲得數量化信息
共聚焦顯微技術不僅能夠對細胞內熒光進行定位, 還可以對其進行定量分析, 獲得二維或三維空間內分布在樣品不同部位的熒光強度數值以及熒光強度在各種處理條件下的變化情況。量化信息的獲得是研究活細胞內生理生化反應時重要的手段, 而共聚焦顯微技術在這一方面的優勢是其他技術所無法達到的。

10. 共聚焦的共焦顯微

共焦顯微技術是由美國科學家M.Minsky在1957年提出的，當時的主要目的是消除普通光學顯微鏡在探測樣品時產生的多種散射光。20世紀60年代通過提高掃描精度突破了普通寬場成像的解析度限制，在20世紀80年代研製成商用共焦顯微鏡。共焦顯微鏡分為普通光照明激發和激光照明激發兩種類型，而以後者應用最為廣泛。
激光掃描共聚焦顯微鏡（Lsaer scanning confocal microscope，LSCM）是一種先進的分子生物學和細胞生物學研究儀器。 它在熒光顯微鏡成像的基礎上加裝激光掃描裝置，結合數據化圖像處理技術，採集組織和細胞內熒游標記圖像，在亞細胞水平觀察鈣等離子水平的變化，並結合電生理等技術觀察細胞生理活動與細胞形態及運動變化的相互關系。由於它的應用范圍較廣泛，已成為形態學、分子細胞生物學、神經科學和葯理學等研究領域中很重要的研究技術。 激光掃描共聚焦顯微鏡工作原理
激光掃描共聚焦顯微鏡的主要原理是利用激光掃描束通過光柵針孔形成點光源，在熒游標記標本的焦平面上逐點掃描，採集點的光信號通過探測針孔到達光電倍增管(PMT)，再經過信號處理，在計算機監視屏上形成圖像。對於物鏡焦平面的焦點處發出的光在針孔處可以得到很好的會聚，可以全部通過針孔被探測器接收。而在焦平面上下位置發出的光在針孔處會產生直徑很大的光斑，對比針孔的直徑大小，則只有極少部分的光可以透過針孔被探測器接收。而且隨著距離物鏡焦平面的距離越大，樣品所產生的雜散光在針孔處的彌散斑就越大，能透過針孔的能量就越少（由10%到1%，慢慢接近為0%），因而在探測器上產生的信號就越小，影響也越小。正由於共焦顯微僅對樣本焦平面成像，有效的避免了衍射光和和散射光的干擾，使得它具有比普通顯微鏡更高的解析度，並在生物學中獲得了廣泛的應用。 共聚焦掃描顯微鏡
共聚焦顯微鏡主要由五部分組成：顯微光學系統、掃描裝置、光源、檢測器和應用軟體系統。整套儀器由計算機控制，各部件之間的操作切換都可在計算機操作平台界面中方便靈活地進行。（1）顯微光學系統：
顯微鏡是共焦檢測系統常用的組件，是系統成像質量的核心部分。顯微鏡光路一般採用無限遠光學系統結構，可以方便地在其中插入光學元件而不影響成像質量和測量精度。物鏡應選取大數值孔徑、平場復消色差物鏡，有利於熒光的採集和成像的清晰。物鏡組的轉換、濾色片組的選取、載物台的移動調節、焦平面的記憶鎖定等都可以由計算機自動控制。
（2）掃描裝置：
掃描裝置是激光共聚焦檢測系統進行大范圍檢測必需的組件，通常有由絲杠導軌組成的XY平移掃描、由陣鏡擺動的掃描等方式。前種掃描方式可以實現大范圍區域的掃描，而後者掃描范圍相對小一些，不過陣鏡擺動掃描可以很快，圖像採集速度可以大大提高，有利於對那些壽命短的離子作熒光測定。掃描系統的工作程序由計算機自動控制，與信號採集相對應。
（3）光源：
光源有單色光（激光）和多色光（汞燈、氘燈、鹵素燈等）。激光源可以使用多譜線氬離子激光器，它提供發射波長為457nm、488nm和514nm的藍綠光；另外，氦氖綠激光器提供發射波長為543nm的綠光，氦氖紅激光器提供波長為633nm的紅光。激光源還可以用其他半導體激光器。
（4）檢測器：
檢測器通常採用光電倍增管（PMT）、光子計數器等，通過高速A/D轉換器，將信號輸入計算機以便進行圖像重建和分析處理。通常在PMT前設置針孔，可以採用固定大小針孔或由計算機軟體來控制的可變大小針孔。如果是檢測熒光，光路中還應該設置能自動切換的濾色片組，滿足不同測量的需要；也可以採用光柵或棱鏡分光然後進行光譜掃描。
（5）應用軟體系統：
應用軟體系統可以根據具體需要設置各種功能，但有一點是共同的，就是將掃描位置坐標與檢測器接收的信號一一對應起來，並以圖像的方式進行儲存與顯示。 共焦顯微鏡從產生至今獲得了巨大的發展，掃描方式從最初的狹縫掃描方式（掃描速度較快，圖像解析度不高），到階梯式掃描技術（提高了圖像解析度，標本制備要求太高），再到驅動式光束掃描器（掃描速度較快，符合共聚焦原理）。另外，激光掃描共聚焦顯微鏡的光源設計和分光採集技術也有較大的改進，主要集中在如下幾個方面：
（1） 現代的激光掃描共聚焦顯微鏡可以根據研究需要選擇不同的激光器。選擇激光光源時，一方面要滿足研究工作對波長的需求，另一個方面要考慮到激光光源的壽命。
（2）最新一代激光掃描共聚焦顯微鏡可以用棱鏡狹縫分光的新技術，配上合適的激光源後，能夠擺脫傳統的波長濾片組的限制，連續和自由地選擇最佳波長。
（3）用於激光掃描共聚焦顯微鏡的物鏡也做了較大的改進，不但具有平場復消色差特性，而且能與高速掃描功能相匹配。
共焦顯微鏡發展至今又產生了新的類型，如針孔陣列盤式激光共聚焦顯微鏡和雙光子共聚焦顯微鏡：
（1）針孔陣列盤式激光共聚焦顯微鏡：
針孔陣列盤式激光共聚焦顯微鏡是為了解決快速變化過程的共聚焦檢測問題而提出的，其核心是雙碟片專利技術，由日本Yokogawa Electric公司發明，包括微透鏡陣列碟片與針孔陣列碟片同步旋轉。
與常規激光共聚焦方法不同，針孔陣列盤式激光共聚焦顯微鏡採用CCD作為探測器，無需載物台進行掃描運動，只要微透鏡陣列碟片與針孔陣列碟片同步旋轉，就可以對物體進行快速共焦檢測，最高全幅採集幀速度達到1000幀/s，是活細胞在體熒光成像的重要工具。
（2）雙光子共聚焦顯微鏡：
雙光子共聚焦顯微鏡
雙光子共聚焦顯微鏡是為了解決生物檢測中樣品染料標記的光漂白現象而提出的，因為共焦孔徑光闌必須足夠小以獲得高解析度的圖像，而孔徑小又會擋掉很大部分從樣品發出的熒光，包括從焦平面發出的熒光，這樣就要求激發光必須足夠強以獲得足夠的信噪比；而高強度的激光會使熒光染料在連續掃描過程中迅速褪色（即光漂白現象），熒光信號會隨著掃描進程的進行變得越來越弱。除此之外，還有光毒作用問題，在激光照射下，許多熒光染料分子會產生諸如單態氧或自由基等細胞毒素，所以實驗中要限制掃描時間和激發光的光功率密度以保持樣品的活性。針對活性樣品的研究，尤其是活性樣品生長、發育過程的各個階段，光漂白和光毒現象將使這些研究受到很大的限制。
雙光子激發原理
雙光子激發的基本原理是：在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時吸收 2 個較低能量（即更長的波長）的光子，在經過一個很短的所謂激發態壽命的時間後，發射出一個波長較短的光子；其效果和使用一個能量較高（即波長為長波長一半）的光子去激發熒光分子是相同的。雙光子激發需要很高的光子密度，為了不損傷細胞，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脈沖寬度只有 100 飛秒，而其周期可以達到 80 至 100 兆赫。在使用高數值孔徑的物鏡將脈沖激光的光子聚焦時，物鏡的焦點處的光子密度是最高的，雙光子激發只發生在物鏡的焦點上，所以雙光子共聚焦顯微鏡不需要共聚焦針孔，提高了熒光檢測效率。
雙光子共聚焦顯微鏡有很多優點：1）長波長的光比短波長的光受散射影響較小容易穿透標本；2）焦平面外的熒光分子不被激發使較多的激發光可以到達焦平面，使激發光可以穿透更深的標本；3）長波長的近紅外光比短波長的光對細胞毒性小；4）使用雙光子顯微鏡觀察標本的時候，只有在焦平面上才有光漂白和光毒性。所以，雙光子共聚焦顯微鏡比普通共聚焦顯微鏡更適合用來觀察厚標本、活細胞，或用來進行定點光漂白實驗。 共聚焦顯微鏡有較高的解析度，而且能觀察到樣本隨時間的變化。因此，共聚焦顯微技術在生物學研究領域起著不可或缺的作用。以下為共焦顯微技術的幾個主要應用方面：
（1）組織和細胞中熒游標記的分子和結構的檢測：
利用激光點掃描成像，形成所謂的「光學切片」，進而可以利用沿縱軸上移動標本進行多個光學切片的疊加形成組織或細胞中熒游標記結構的總體圖像，因此可以用於觀察切片和一些表面不平的標本，特別是研究具有長突起的神經元時更有使用價值。同時可以做三維圖像重建和標記強度的半定量分析。
（2）定量或半定量測量Ca2+和pH等細胞內離子濃度及變化：
激光掃描共聚焦顯微鏡可以提供更好的亞細胞結構中鈣離子濃度動態變化的圖像，這對於研究鈣等離子細胞內動力學有意義。最好與電生理等技術相結合來觀察離子變化與電生理學指標的相關性。
（3）熒光光漂白及恢復技術：
利用高能量激光束將細胞內某一部分中選定靶區域的某種熒光淬滅，然後觀察鄰近相同的熒游標記物重新擴散入該區域的速度和方式，從而分析細胞內蛋白質運輸、受體在細胞膜上的流動和大分子組裝等細胞生物學過程。
（4）長時程觀察細胞遷移和生長：
激光掃描共聚焦顯微鏡的軟體一般均可自動控制地進行定時和定方式的激光掃描，而且由於新一代激光掃描共聚焦顯微鏡的探測效率的提高，只需要很小的激光能量就可以達到較好的圖像質量，從而減小了每次掃描時激光束對細胞的損傷，因此，可以用於數小時的長時程定時掃描，記錄細胞遷移和生長等細胞生物學現象。
（5）其他的生物學應用：
用高能量激光束進行細胞損傷和損毀實驗，一般要用紫外激光束進行細胞損毀；細胞間通訊研究；光解籠鎖活化技術等。